根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，我部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法，现予发布，自发布之日起执行。
特此公告。
附件：1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法
2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
下载文件： 公告第2078.ceb
农业部
2014年3月12日
附件1
口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml离心管中，置50±5℃水浴90分钟，然后在4℃条件下，以15000 g离心10分钟，取水相5.0 ml，按现行《中国兽药典》一部附录进行检验。每头份疫苗中内毒素含量应不高于50 EU。
附件2
口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
取1瓶疫苗恢复至室温，在3个1.5ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶后，按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高于500μg。
附注：口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
1.方法与原理
本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检测。本法系福林酚法(lowry法)，依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cμ2 螯合形成蛋白质－铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
2.试剂与仪器
2.1试剂丙酮（分析纯）、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒；
2.2设备酶标仪（全波长），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，单通道和多通道移液器，涡旋震荡仪，酶标板振荡器等。
3.操作步骤
3.1标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀释。
|
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
母液（μl） |
0 |
5 |
25 |
50 |
100 |
150 |
200 |
300 |
400 |
|
去离子水（μl） |
400 |
395 |
375 |
350 |
300 |
250 |
200 |
100 |
0 |
|
终浓度（μg/ml） |
0 |
25 |
125 |
250 |
500 |
750 |
1000 |
1500 |
2000 |
3.2检验疫苗处理取1瓶疫苗恢复至室温摇匀后，在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000 g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶备用。
